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TRIzol（總RNA提取試劑）

貨號：ZK-PL4160

品牌：子科生物ZIKER

描述：TRIzol是一種快速從組織細胞中提取總RNA的單相試劑。在樣品裂解過程中TRIzol能夠抑制RNA酶活性保持RNA完整性；加入氯仿后離心，RNA相將與DNA和蛋白質分離，隨后用異丙醇沉淀RNA。如果需要還可以繼續提取DNA和蛋白質。純化的總RNA可用于RT－PCR、Northern Blot、RNA酶保護、Poly(A) mRNA純化、體外翻譯等實驗。

儲存: 4℃密封避光保存兩年有效。

適用:

(1) 固體組織 (100 mg /ml ): 人、動物、植物的各種新鮮或凍存組織。

(2) 培養細胞 (5~10 x 106細胞/ml): 真核細胞，細菌，酵母。

(3) 液體標本(100 μl/ml): 全血、體液、尿液，病毒樣品等。

操作準備：

極微量的RNA酶都會導致RNA降解。分離RNA時RNA酶污染主要來自以下五個方面：(1) 實驗人員的雙手。(2) 器皿、吸頭離心管、自備液體。(3) 組織細胞破碎不可避免地釋放的內源RNA酶。(4) RNA未能完全與蛋白質分離。(5) RNA沉淀和溶解時來自吸頭離心管和溶液。Trizol可抑制RNA酶活性, 因此在有Trizol存在的步驟中，使用高壓消毒20分鐘的吸頭離心管和溶液即可勝任RNA提取操作。然而在RNA溶解之后，來自實驗材料的RNA酶污染將會導致RNA降解，應嚴格使用高壓滅活RNA酶的用品。戴手套無疑是有益的，但戴口罩和帽子則無必要。

1. 固體組織破碎設備。準備下列裝置之一，

1)玻璃勻漿器。必要時泡酸清潔，用高壓滅菌蒸餾水洗滌數次。

2)研缽。適用于液氮凍存組織的研磨，清洗方法同玻璃勻漿器。

3)組織細胞超聲破碎儀器。探頭插入裝滿蒸餾水的試管或燒杯中，開啟超聲清洗探頭30秒至1分鐘。4)高速機械勻漿器(Polytron，Tekmar或類似產品)。打開開關，在蒸餾水中清洗分散器頭數次。

2. 高壓蒸汽30分鐘消毒一次性吸頭離心管。RNA沉淀和溶解之后，應嚴格使用高壓消毒的一次性用品。由于不可預測的原因，如：動物已經處死，組織已取出，細胞已收取，而吸頭和離心管尚未高壓處理。此時保險做法是使用普利萊基因技術公司的另種產品――組織RNA保護液(Cat# R1030)，用戶可把來不及處理的標本保存在RNA保護液中，37 oC保存3天，25 oC保存2周，4 oC保存4周，－20 oC保存數月，固體或液體標本中RNA不會降解。

3. DEPC處理的雙蒸水。加DEPC到水中至終濃度為0.01% v/v，室溫過夜，高壓消毒30分鐘。用于溶解RNA，配制TE緩沖液和75％乙醇。

4. 普通雙蒸水。高壓消毒30分鐘，用于沖洗器皿，配制瓊脂糖凝膠和電泳用緩沖液。注意溶液配制后高壓滅菌，但瓊脂糖不能高壓處理。

5. 冰盒和濕冰。在冰上進行操作有助于減少RNA降解。

6. 異丙醇，氯仿，純乙醇，分析純。75％乙醇用高壓消毒的蒸餾水配制。

7. 其它用品。電泳槽，雙蒸水沖洗。離心機和加樣器，無需處理。

8. 戴手套。注意某些實驗如提取質粒DNA使用大量RNA酶，為防污染須特別清洗實驗器具和實驗區域。

RNA提取程序：

1. 組織細胞破碎與裂解

冰上操作快速破碎組織至關重要。組織細胞過量不僅使RNA得率下降，還將導致DNA和蛋白質污染。

(1) 固體組織。按比例每50-100 mg組織加1 ml Trizol試劑。用研缽研磨：僅適用于液氮凍存組織。組織放在研缽中研成粉末，加1 ml Trizol試劑，繼續研磨至組織完全裂解。用玻璃勻漿器勻漿：加入Trizol上下手動勻漿組織10-15次。用高速機械勻漿器：將組織放入塑料試管內，試管置冰浴燒杯中，加入Trizol試劑，將分散器頭垂直插入管內與組織塊接觸，轉速12,000-20,000 rpm，上下移動試管10-20次，直到組織完全打散，無肉眼可見大塊。用超聲儀：根據機器型號進行預試驗，選取能有效破碎組織的功率和時間。

注意：

(1)由于Trizol卓越的性能，通常用50-100 mg組織可獲得足量的RNA，對絕大多數實驗目的綽綽有余。加入過量組織或過少Trizol容易導致提取失敗。

(2)少量難以打碎的組織碎片不影響后續RNA提取。

(3)用研缽和玻璃勻漿器勻漿破碎組織時，應略微多加一些裂解液，以補充裂解產物粘在容器壁上造成的體積丟失。

(2) 培養細胞。貼壁細胞：棄培養基，用PBS緩沖液沖洗細胞一次。每5-10′106個細胞加1 ml Trizol試劑，但Trizol加入量必須有效地覆蓋瓶皿的細胞表面。一個75 cm2瓶皿的細胞通常需要2 ml提取液，一個35 cm2瓶皿的細胞需要 1 ml提取液，更小的培養瓶皿可使用更少的提取液，但后續操作會因體積過小而極為不便。晃動或用吸頭吹打使提取液流過并裂解所有細胞。置冰上5分鐘，傾斜瓶皿使粘稠的裂解物聚于一處以便取出。懸浮細胞：低速離心收集細胞，將細胞快速重懸于50-100ml的PBS或去離子水中，每5-10′106細胞加1 ml Trizol裂解。注意直接裂解未重懸的細胞沉淀，裂解物將十分粘稠而難以分散。細菌酵母：離心收集沉淀，加入50-100ml去離子水重懸細胞。每107細胞加入1-2 ml Trizol直接裂解。某些細菌和酵母細胞可能需要勻漿破碎。

(3) 液體標本：如體液、尿液、全血。每100ml液體樣品加1 ml Trizol，置冰上1-3分鐘。未抗凝的凝固血液按固體組織處理。Trizol Liq (Cat# R1020)產品專門用于液體標本RNA提取。

2. 將組織細胞裂解物轉移到1.5 ml離心管，置冰上10分鐘。

優化步驟：如果組織裂解物含較多的碎片，或提取植物組織，12,000g 4 oC 離心10 分鐘，取上層裂解液，棄管底碎片和粘稠DNA。如果提取脂肪組織，12,000g 4 oC 離心10 分鐘，小心吸掉最上面的油層，棄去。再取裂解液，棄管底碎片和粘稠DNA。取出的裂解液如帶少量油滴不影響提取。

3. 加入0.2體積的氯仿(0.2ml)，充分顛倒混勻，冰上孵育1-5 分鐘，溶液開始分相。有時分相不明顯，不影響提取。

4. 離心12,000 ′ g 4 oC 10分鐘，溶液分為兩相。RNA在上層水相，下層為有機相，兩相界面是一層薄膜其厚度與組織細胞類型和多少有關。小心吸出0.5ml上層水相轉移到新離心管。

注意：取上清液時應保留0.5-1 mm厚的水相，以免擾動和吸入下面的碎片和有機相。如果吸入，應將所取的上清液放回管中并重新離心10分鐘，再次吸取水相。這一點至關重要，違背此原則容易導致RNA降解和DNA污染。如需同時提取DNA或蛋白質，則保留中間相和下層有機相，向公司索要操作方法。

5. 加入等體積異丙醇(0.5ml)于上清液充分混勻。冰上孵育10 分鐘沉淀RNA。用更低的溫度和更長的時間進行沉淀并不必要。如果起始組織細胞的量很少，－20 oC放置一至數小時可沉淀幾乎所有的RNA。

注意：從富含多糖的植物組織或富含糖原的動物肝臟組織提取RNA時，按以下步驟進行：以每1 ml Trizol裂解組織，加氯仿后離心得到約0.5 ml上清液計算，分別加入上清液一半體積即0.25 ml 的高鹽溶液(0.8 M 檸檬酸鈉和1.2 M NaCl)和0.25 ml異丙醇，混勻。執行下面的離心沉淀步驟6。離心后可有效沉淀RNA，但多糖或糖原存留在上清可被棄去。從富含多糖的植物和動物肝臟組織提取RNA時，推薦使用植物RNA分離試劑Plant Trizol或Plant RNA Extraction Kit。

6. 12,000g，4 oC 離心10分鐘。管底可見少許RNA沉淀。

注意：如初始組織細胞量少，RNA將附著在管壁，用肉眼幾乎難辨沉淀，但不影響實驗。如RNA沉淀量很多并呈膠凍狀，通常表明有蛋白污染。應仔細檢查操作步驟。

7. 棄上清。立即加入1ml 75%乙醇，顛倒混勻數次洗滌沉淀。12,000g離心5分鐘。棄上清，盡量完全吸去管壁上的液體。

注意：乙醇洗滌后RNA沉淀容易漂浮，勿倒掉或吸走RNA沉淀。RNA沉淀在75%乙醇中可在4 oC

保存一周或在－20 oC保存一年。

8. 敞開管口，空氣干燥5-10分鐘使殘留液體揮發，RNA略微沉淀干燥即可。用50-100 ml自備的DEPC處理的高壓消毒純水或TE溶解沉淀。RNA溶液可保存于－70 oC或液氮中。

注意：過分干燥將使RNA難以溶解。55 oC加熱或反復凍融數次可以助溶。RNA溶液加3倍體積乙醇凍存于－20 oC，用時離心沉淀。

說明：

1. 每100mg組織RNA預期得率為：肝脾60－100mg, 腎50mg, 腦組織10-15mg, 胎盤20－40mg, 脂肪50mg。1 x 107個細胞通常得50－100mg。

2. 測定OD值，根據OD260計算RNA濃度。OD260/280比值可初步判斷RNA質量，比值在1.6-2.0之間均屬正常。起始組織量過大，或吸取了有機相或碎片，將使RNA樣品中蛋白和雜質含量高，RNA沉淀乙醇洗滌不充分(步驟8)，均可導致OD260/280比值降低。例如，RNA用水溶解或pH偏酸OD260/280偏低，用TE或離子強度較高的溶液溶解時較高，但均不影響RNA后續使用。切記即便是已降解的RNA，OD260/280比值也能達到看似完美的2.0左右，因此該比值并非判斷RNA降解與否最佳的指標。判斷RNA質量的最佳途徑是進行普通RNA瓊脂糖電泳檢查RNA完整性。

3. 檢查RNA完整性。取1 mg RNA樣品進行1%普通瓊脂糖凝膠電泳。溴化乙錠染色，紫外燈觀察。28S RNA~5 kb亮度應該約為18S RNA~2 kb的兩倍，有時可見0.1-0.3 kb 的5S RNA。

4. 調整RNA溶液的體積或重沉淀RNA。(1) 加入適量DEPC處理過的高壓消毒純水或TE緩沖液，于RNA溶液中，使溶液體積補齊到約400 ml；(2) 加入 0.1 體積的3M 醋酸鈉 pH 5.2，混勻；(3) 加入2.5體積的純乙醇，混勻；(4) 冰上孵育10 分鐘；(5) 12,000g 4 oC 離心10 分鐘，棄上清；(6) 執行上述RNA提取程序的步驟6－8。

5. Trizol勿直接接觸皮膚和吸入。如接觸皮膚，立即用大量水清洗。