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組織細胞丙二醛（MDA）檢測試劑盒（TBA法）

貨號：ZK-PL3997

品牌：子科生物/ZIKER

描述：組織細胞丙二醛（MDA）檢測試劑盒是一種靈敏簡單的檢測脂質過氧化產物丙二醛的試劑盒。丙二醛（Malondialdehyde, MDA）是一種生物體脂質氧化的天然產物，一些脂肪酸氧化后逐漸分解為一系列包括MDA在內的復雜化合物，通過檢測MDA的水平可評價脂質氧化的水平，因此MDA的測定被廣泛用作脂質氧化的指標。

本試劑盒是一種基于MDA和硫代巴妥酸（thiobarbituric acid, TBA）在較高溫度和酸性環境中反應生成紅色MDA-TBA加和物，MDA-TBA加和物在535nm波長具有最大吸收，據此可以通過比色法進行檢測。另外MDA-TBA受535nm波長激發光激發，在553nm波長發出熒光，因此，可以通過熒光法檢測MDA濃度。熒光法相對比色法靈敏度提高一個數量級。

反應示意圖如下：

試劑盒以比色法檢測線性范圍為1.56-50μM，靈敏度≤1.56μM；熒光法檢測線性范圍為0.156-5μM，靈敏度≤0.156μM

適用：本試劑盒能夠檢測動物組織、培養細胞等樣本中MDA含量。

組成：

儲存條件：-20℃儲存，一年有效。TBA配制成溶液后，可4℃避光儲存一周。SDS溶液使用前，請恢復至室溫并徹底溶解后使用，首次使用后4℃儲存即可。

需要而未提供的試劑及器材

1. 超純水

2. 0.1M PBS(PH7.0-7.4)和EDTA

3. 系列可調節量程移液器及吸頭

4. 干凈的試管、離心管及96孔板

5. 酶標儀

操作步驟：

1. 樣品的準備

1.1 細胞樣品的準備：收集約2×106～2×107個新鮮細胞，PBS洗滌細胞一次，離心收集細胞，吸盡上清加入300 μl的中等強度RIPA裂解液（提前加入100×的抗氧化劑BHT）冰浴裂解30分鐘。4℃，10000g離心10分鐘。取上清用于MDA定量測定。不立即測定的樣品可以-70℃保存。對于細胞量差別大的樣本請利用BCA蛋白定量法測定細胞裂解液上清中總蛋白濃度，以校正MDA測定結果。

1.2 組織樣品的準備：利用含1mM EDTA的PBS灌流或漂洗組織，去除組織中的血液，然后取約10 mg組織，加入500 μl的中等強度RIPA裂解液（提前加入100×的抗氧化劑BHT），冰浴勻漿。4℃，10000g離心10分鐘。取上清用于MDA定量測定。不立即測定的樣品可以-70℃保存。另外請利用BCA蛋白定量法測定組織裂解液上清中總蛋白濃度，以校正MDA測定結果。

 2. 試劑盒的準備

2.1 TBA溶液的配制：將本試劑盒提供的1管50 mg TBA倒入50ml離心管中，再加入7.5ml TBA配置震蕩2分鐘溶解TBA，然后加入17.5ml的純水，徹底溶解TBA，可以超聲助溶，即為TBA溶液，濃度為2mg/ml。

3. 標準品的準備

比色法標準品的配制：在1.5ml離心管中，加入950μl純水，再取50μl的1 mM濃度MDA標準品加入離心管中配制50μM濃度MDA標準品；然后取另外5根1.5ml離心管，分別加入500μl純水，再吸取500μl的 50μM濃度MDA標準品依次倍倍稀釋為25、12.5、6.25、3.12、1.56μM濃度。

熒光法標準品的配制：在1.5ml離心管中，加入1ml純水，再取5μl的1mM濃度MDA標準品加入離心管中配制5μM濃度MDA標準品；然后取另外5根1.5ml離心管，分別加入500μl純水，再將500μl的5μM濃度MDA標準品依次倍倍稀釋為2.5、1.25、0.625、0.312、0.156μM濃度。

測定方法

1. 在1.5 ml離心管中，按下表進行配制：

一般情況下,對照管每批只需做1-2支，若樣本不存在溶血、脂血現象，對照管可以不做。

2. 將離心管置于95℃水浴或金屬浴反應30分鐘，然后冰浴冷卻至室溫。

3. 10000g離心10min，取200 μl上清溶液，測定吸光度（535nm）或發射的熒光強度（ex535nm-em553nm）。

數據處理

利用MDA標準品濃度為橫坐標，吸光度值或發射熒光值為縱坐標制作標準曲線，并獲得橫縱坐標之間的函數關系式，然后利用標準曲線和各樣品的吸光度值或發射熒光值計算樣品的MDA濃度。細胞裂解上清和組織勻漿上清，可以計算每毫克蛋白中的MDA量MDA標曲測定結果如下圖所示：

注意事項

1. 血紅蛋白對測定有一定干擾，請盡量避免血漿和血清制備過程中的溶血。

2. TBA配制成溶液后不夠穩定，要在4℃避光儲存，一周內用完。

3. 初次使用試劑盒時，粉末試劑和小體積液體試劑請適當離心后使用。

4. 本產品僅限專業人員用于科學研究，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品。

5. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。